黄曲霉毒素分析-HPLC检测对比实验

一、介绍

黄曲霉毒素是由生活在热带或亚热带地区的黄曲霉，寄生曲霉和曲霉等微生物产生的一组霉菌毒素，具有强烈的致癌作用。据报道，经常发现黄曲霉毒素含量较高，超过食品安全机构（如FDA）在各种食品（包括水果，豆类，谷物和香料）中规定的安全水平。

目前的法规要求总黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2的总和）必须低于10μg/ kg。本次实验使用三氟乙酸（TFA）与HPLC结合荧光检测的柱后衍生法进行黄曲霉毒素分析。该方案可大大提高检测黄曲霉毒素B1和G1的灵敏度。度除衍生方法外，多功能柱或免疫亲和柱的使用可用于提高样品制备过程中的再现性和回收率。

二、试验

●   常规HPLC

●   UHPLC

●   结构体

黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2是产生天然荧光的化合物。然而，B1和G1的荧光强度与B2和G2的荧光强度相比要小得多，因此，必须通过使用TFA衍生化从天然形式转变为羟基化形式来提高黄曲霉毒素B1和G1分析的灵敏度。黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2的结构以及衍生的B1和G1的结构如图所示：

图1.黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2和TFA衍生的B1和G1的结构

●   Derivatizaton

黄曲霉毒素和实际样品的标准混合物的TFA衍生化程序如图所示：

图2. TFA衍生化
* 1为了避免黄曲霉毒素吸附到容器内壁上，必须用乙腈和Milli-Q水冲洗容器，然后干燥。

●   样品制备

选择玉米粗粉和烤花生作为测试样品，并使用多功能柱用于玉米粗粒的样品制备，而免疫亲和柱用于制备烤花生。样品制备程序如图3所示。

1.玉米糠

2.烤花生

* 1在恢复估计试验中，将使用在重铬酸盐/ Milli-Q水（90/10）中的黄曲霉毒素（各自为0.5 11g / L）的标准混合物。
* 2多功能柱中有三种分离模式（反相，正相和离子交换）。（RomerLabs）
* 3免疫亲和柱（HORIBA）利用抗黄曲霉毒素单克隆抗体和黄曲霉毒素之间的独特结合能力。
* 4让色谱柱平衡至室温。小心地在上盖上的孔上打孔，使空气不会进入凝胶，然后取上盖和下盖。
* 5用0.20克氯化钾，0.20克磷酸二氢钾，1.16克磷酸氢二钠和8.0克氯化钠（pH7.4）至1升配制Milli-Q水溶液。
* 6小心冲洗色谱柱，使空气不会进入凝胶。
* 7最大限度地减少乙腈中最终洗脱液的含水量。如果最终洗脱中的水含量相对较高，则消除溶剂需要更长的时间，这可能导致黄曲霉毒素的变性。
* 8完全从凝胶中释放相互作用的黄曲霉毒素。

三、结果

黄曲霉毒素分析实验结果显示：TFA衍生的黄曲霉毒素（各自为5.0μg/ L）的标准混合物的色谱图如图4所示[通过常规HPLC（上部），通过UHPLC（下部）]。通过常规HPLC在12分钟内完成分离，并在3.5分钟内通过UHPLC完成分离。

黄曲霉毒素的标准混合物的线性范围为0.5至10μg/ L，常规HPLC和UHPLC均具有优异的相关性r2。

对于常规HPLC，在峰值保留时间和面积上分别具有优于0.2％RSD和3％RSD的良好再现性，包括TFA衍生化程序（N = 6）。UHPLC还具有良好的重现性，峰值保留时间和面积分别具有优于0.2％的RSD和3.5％的RSD。将1.0ug / L的黄曲霉毒素标准混合物用于该估计。

图4.黄曲霉毒素标准混合物的色谱图（每种5.0μg/ L，TFA衍生化）1 =黄曲霉毒素G1,2 =黄曲霉毒素B1,3 =黄曲霉毒素G2,4 =黄曲霉毒素B2

使用样品制备中的多功能柱（MycoSep 226AflaZon +）制备的玉米粗粒样品的色谱图显示在图5中（常规HPLC和UHPLC）。来自玉米粗粒的样品和掺有黄曲霉毒素的标准混合物的样品用于黄曲霉毒素的恢复估计。在色谱图中几乎没有观察到污染物峰，并且对于常规HPLC和UHPLC都获得了标准黄曲霉毒素的良好回收率，分析结果如表1所示。

在样品制备中使用免疫亲和柱（AFLAKING）制备的烤花生样品的色谱图显示在图6中（常规HPLC和UHPLC）。来自烤花生的样品和掺有黄曲霉毒素标准混合物的样品用于黄曲霉毒素的恢复估计。在色谱图中几乎没有观察到污染物峰，并且对于常规HPLC和UHPLC都获得了标准黄曲霉毒素的良好回收率，分析结果如表2所示。

图5.来自玉米粒的纯化溶液的色谱图1 =黄曲霉毒素G1,2 =黄曲霉毒素B1,3 =黄曲霉毒素G2,4 =黄曲霉毒素B2

图6.来自烤花生的纯化溶液的色谱图1 =黄曲霉毒素G1,2 =黄曲霉毒素B1,3 =黄曲霉毒素G2,4 =黄曲霉毒素B2

表1.标准黄曲霉毒素的回收率[％]